De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Het optimaliseren van DNA extractie uit "Formalin-Fixed Paraffin-Embedded" materialen

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Het optimaliseren van DNA extractie uit "Formalin-Fixed Paraffin-Embedded" materialen

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Samenvatting
Er worden met moleculaire technieken bepalingen uitgevoerd waarbij weefsels worden
gebruikt die in formaline zijn gefixeerd en in paraffine ingebed. De fixatie van de
weefsels veroorzaakt kruisverbindingen tussen biomoleculen en degradeert de eiwitten
en nucleïnezuren in kleine fragmenten met het gevolg dat PCR-resultaten wisselend zijn,
omdat het DNA niet optimaal geamplificeerd wordt. Een ander probleem bij PCR
amplificatie is het ontstaan van zogenaamde primer-dimers: PCR producten die
afkomstig zijn van de primers en niet van genomisch DNA. Sub- optimale PCR en primerdimers
vormen problemen bij de analyse van DNA.
Het doel van deze studie was om met drie verschillende DNA-isolatiemethoden en
drie verschillende DNA polymerases uit te zoeken welke combinatie het best
geamplificeerde DNA opleverde. De onderzochte isolatiemethoden waren de chelex-100
resin methode, de standaardmethode en de NucleoSpin® Tissue XS kit methode. Bij de
chelexmethode is verder onderzocht wat het effect is van het gebruik van
gedeparaffineerde en ongedeparaffineerde coupes. De onderzochte DNA polymerases
waren GoTaq, Phusion and HotStart DNA polymerases.
Voor het onderzoek zijn 16 verschillende paraffineweefselblokjes gebruikt,
afkomstig uit long- en darmweefsel uit 1996, 2000, 2004 en 2008. Van de blokjes
werden coupes van 10 μm dikte gesneden voor DNA isolatie. Exon 5 (2 fragmenten om
hele exon te omvatten), 6, 7 en 8 van het TP53 gen werden geamplificeerd en dit PCR
product werd gesequenced met behulp van automatische DNA-analyse apparatuur
gebaseerd op capillaire gelelectroforese (ABI).
Uit de vergelijking van de verschillende DNA-isolatiemethoden bleek de
chelexmethode een hogere DNA opbrengst te geven. Er was geen verschil tussen het
gebruik van gedeparaffineerde of ongedeparaffineerde coupes. De monsters die met de
chelexmethode geïsoleerd waren, leverden meer PCR-product op. De intensiteit van de
banden op gel waren sterker bij de weefsels van 2008, 2004 en 2000 dan bij de weefsels
van 1996. Monsters die met de standaardmethode waren geïsoleerd gaven geen PCRproduct
bij grote fragmenten (417 bp), terwijl de monsters die met de chelex- en
tissuekitmethode geïsoleerd waren wel geamplificeerd werden. Bij de sequentieanalyse
bleek dat de chelexmethode duidelijk interpreteerbare pieken opleverde, in tegenstelling
tot de standaardmethode. Het gebruik van GoTaq enzym resulteerde in de meeste
primer-dimer producten terwijl HotStart Taq polymerase de minste primer-dimers
voortbracht. De conditie 20 ng DNA met 5 μM primers gaf de optimale PCR-amplificatie
met de minste primer dimers.
De resultaten van deze studie wijzen erop dat het gebruik van de chelex
isolatiemethode in combinatie met het enzym HotStart Taq en meer dan 10 ng DNA
template voor oude weefsels de beste keus is voor moleculair diagnostische bepalingen
waarbij gebruik wordt gemaakt van DNA amplificatie.

Summary
Molecular techniques are used to analyse biological substances. For these analyses,
tissues are used that are fixed in formaline and subsequently embedded in paraffin.
Fixation of tissues causes crosslinkage of biomolecules and degrades proteins and nucleic
acids in small fragments. When subsequently DNA is isolated from these tissues, it
represents a difficult template that is often not optimal amplified or generates primer
dimers during PCR reactions. The purpose of this study was to find out which of three
different DNA isolation methods generates the best amplifiable DNA. The methods were
the chelex-100 resin method, the standard method and the NucleoSpin® Tissue XS kit
method. The chelex method was used with and without deparaffiniztion of the tissue
sections. Sixteen different paraffin tissue blocks were used, derived from lung and
intestine and originally embedded in the years 1996, 2000, 2004 and 2008. Each block
was sectioned 10 times with each section being 10 μm thick. Next we investigated which
of three DNA polymerases (GoTaq, Phusion, and HotStart Taq DNA polymerase) gave the
least primer dimers. Sequence analysis was carried out with TP53 primers for exons 5
(two different fragments to cover the entire exon), 6, 7 and 8 and capillary
gelelectrophoresis by an ABI DNA analysis apparatus.
The chelex method gave the highest total amount of DNA. There was no difference
between the sections with and without deparaffinization. Samples that were isolated with
the chelex method appeared to be more successfully amplified. The level of amplification
of tissues from 2008, 2004 and 2000 was higher than that of tissue from 1996. DNA
isolated with the standard method was not amplified, while DNA isolated with the chelex
method and Tissue Kit method was. The samples that were isolated with these latter
methods were amplified with primers for exons 5, 6, 7 and 8 of the TP53 gene. samples
that were isolated with the chelex method had peaks that were easier to interpret. GoTaq
enzyme gave the most primer dimers , whereas HotStart Taq polymerase gave the best
results. The combination of 20 ng DNA and 5 μM primers gave an optimal PCR product
with the least primer dimers.
The results of this study show that the use of the chelex isolation method in
combination with the enzyme HotStart Taq and with more than 10 ng DNA template is
the best choice for molecular diagnostic methods that use DNA amplification.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersJosephine Nefkens Instituut, Erasmus MC, Rotterdam, afdeling pathologie
Jaar2009
TypeBachelorscriptie
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk