De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Molecular insight into the activation of Liver Progenitor Cells

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Molecular insight into the activation of Liver Progenitor Cells

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Summary

At the faculty of Veterinary Medicine, Utrecht University in the Netherlands, liver regeneration is one of the main subjects of the research program Tissue Repair. Subjects of the program are pathophysiology, tissue dysfunction and potential mechanisms for repair. The General target is to understand the way liver progenitor cells (LPCs) proliferate and differentiate; it may be possible to stimulate the patient's own progenitor cell compartment, which may delay or even prevent the need for organ transplantation. Because it is not possible to grow/study LPCs in culture there is a need for cell-lines which mimic the characteristics and function of this cell type. Therefore this study was initiated to find suitable cell-lines for LPC research and to set up differentiation studies. The human cell-lines HepaRG, HepG2 and THLE5b cell-line are the cells of interest, because several recent studies have suggested that they have liver progenitor properties. The specific aim of the study is to provide more insight in the cellular processes which leads to proliferation and differentiation of bipotent LPCs to cholangiocytes and/or hepatocytes. The following research questions were relevant for this aim:

• Are the cells of interest, the human cell-lines HepaRG, HepG2 and THLE5b suitable as LPC-like cell-lines?
• Do the LPC-like cell-lines possess characteristics such as receptors and ligands for the Wnt and Notch signalling pathway, a prerequisite for further study of the specific activation mechanisms involved in the proliferation and differentiation of LPCs?

The cell culturing protocols for the cells of interest were first optimized. The following techniques then were used to determine the amount of differentiation of the cell-lines and also to possible manipulation of the Wnt and Notch pathway; Immunocytohemical staining of the characteristic markers K19, HepPar-1; Albumin and MRP2 (ABC transporter); gene expression on Wnt, Notch LPC, stem cell, hepatocyte and cholangiocyte markers; in vitro assay on the common clinical proteins ALT, AST, Urea, GGT, GLDH and total proteins; and in vitro assay of P450 Cytochrome 3A4.

Results showed that K19 was the only marker positive on all cell-lines. The HepaRG staining need to be optimized in future studies. Staining with Albumin and MRP2 were negative. Gene expression studies suggests that the HepaRG is in the most differentiated phase; hepatocyte markers ALB and HNF4A were suggest to be expressed, also cholangiocyte marker HNF1B showed only expression in this cell-line. The THLE5b cell-line approaches the LPC closely, because it expressed al the LPC markers KRT7, KRT19, TACSTD1, NCAM, AFP2 and TNFSRF12A. The HepG2 cell-line can be considered to be in a state between the HepaRG and THLE5b cell-lines. In vitro assays showed that all cell-lines contain the liver enzymes alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase and glutamate dehydrogenase. Gamma-glutamil-transferase was only missing in the HepaRG cell-line. Urea could not been measured. Cytochrome 3A4 was present and active in all three cell-lines. For all cells lines the total protein was determined.

The overall conclusion is that the THLE5b cell-line has the most LPC characteristics based on gene-expression profiling, biochemical analysis and immunocytochemistry. All cell-lines under study can be used for proliferation or differentiation studies by manipulating the Wnt or Notch pathway. To assess the amount of differentiation several studies have been successfully developed.

Summary Dutch
Op de faculteit diergeneeskunde, Universiteit Utrecht, in Nederland is levergeneratie een hoofdonderwerp van het onderzoeksprogramma Tissue Repair. In het programma wordt onderzoek gedaan naar de pathofysiologie van weefseldysfunctie en potentiële mechanismen voor de regeneratie. Het algehele doel is om te begrijpen op welke wijze de lever progenitor cellen (LPCs) prolifereren en differentiëren; het is wellicht mogelijk om het progenitor cel compartiment van de patiënt zelf te stimuleren, wat misschien op zijn beurt orgaantransplantatie uitstelt of uitsluit. Omdat het niet mogelijk is om LPCs the kweken en te onderzoeken, is er vraag voor een cellijn die overeenkomstige functies van deze cellen waarborgt. Deze studie is dan ook voorgesteld om een geschikte cellijn te vinden voor LPC onderzoek en differentiatie studies. De humane cellijnen HepaRG, HepG2 en THLE5b, zijn van interesse, omdat verscheidene recente studies suggereren dat ze lever progenitor eigenschappen bezitten. De algemene doelstelling van de studie is het verkrijgen van meer inzicht in de cellulaire processen welke lijden tot proliferatie en differentiatie van bipotent LPCs naar cholangiocyten en/of hepatocyten. De volgende onderzoeksvragen zijn relevant voor dit doel:

• Zijn de cellen van interesse, de humane cellijnen HepaRG, HepG2 en THLE5b toepasbaar als LPC-achtige cellijnen?
• Hebben de onderzochte cellen in hun celmembranen karakteristieken zoals receptoren en liganden die nodig zijn voor de Wnt en Notch signaleringsroutes?

De celkweek protocollen zijn eerst geoptimaliseerd. De volgende technieken zijn daarna toegepast om de mate van differentiatie van de cellijnen en ook de aanwezigheid van receptoren van de Wnt en Notch signaleringsroute aan te tonen; Immunocytochemie kleuringen van de karakteristieke markers K19, HepPar-1; Albumine en MRP2; Gen expressie op Wnt, Notch LPC, Stam cel, Hepatocyt and Cholangiocyt markers; in vitro bepaling op de veelvoorkomende leverenzymen ALT, AST, Ureum, GGT, GLDH en op aanwezigheid van het totaal aan eiwit alsmede de in vitro bepaling van P450 Cytochroom 3A4.

Resultaten toonden dat K19 de enige marker was die positief is op alle cellijnen. De HepPar-1 kleuring dient geoptimaliseerd te worden in toekomstige studies. Kleuring met Albumine en MRP2 waren negatief. Gen expressie toonde aan dat de HepaRG in de meest gedifferentieerde fase zit; hepatocyt markers ALB en HNF4A kwamen tot expressie, ook cholangiocyt marker HNF1B toonde alleen expressie in de cellijn. Daarentegen benaderd de THLE5b cellijn het meest de LPC fase, omdat alle LPC markers KRT7, KRT19, TACSTD1, NCAM, AFP2 en TNFSRF12A tot expressie kwamen. De HepG2 cellijn kan worden beschouwd als een cellijn in een fase tussen de HepaRG en THLE5b cellijnen. In vitro bepalingen toonde aan dat alle cellijnen de enzymen alanine aminotransferase, aspartate aminotransferase, glutamate dehydrogenase. Gamma-glutamil-transferase ontbrak echter in de HepaRG cellijn. Ureum kon niet worden gemeten. Cytochroom 3A4 was aanwezig en actief in alle drie de cellijnen waarvan ook het totale eiwitgehalte werd bepaald.

De algemene conclusie is dat de THLE5b cellijn de meest LPC karakteristieken heeft gebaseerd op genexpressie proliferering, biochemische analyse en immunocytochemie. Alle bestudeerde cellijnen kunnen worden toegepast voor proliferatie of differentiatie studies door manipulatie van de Wnt of Notch signaleringsroute. Verschillende studies zijn succesvol ontwikkeld om de mate van de differentiatie te bepalen.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
PartnersFaculteit Dierengeneeskunde, departement Geneeskunde van gezelschapsdieren; Universiteit Utrecht
Jaar2009
TypeBachelor
TaalEngels

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk