De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Kwantificering van HER2/ERBB2 in weefsels

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Kwantificering van HER2/ERBB2 in weefsels

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Introductie: Kanker kost in Nederland jaarlijks 33,000 mensen het leven. In Nederland komt borstkanker (mamacarcinoom) in ‘’vergelijking met de rest van de wereld’’ relatief veel voor, naar verwachting zal één op de acht vrouwen in haar leven een vorm van borstkanker krijgen. Gedurende deze stage is onderzoek gedaan naar borsttumoren op grond van hun humane epidermale groeifactor receptor 2 [HER2/neu, gen naam: ERBB2] status. Patiënten met HER2/ERBB2 positieve tumoren hebben een slechte prognose. Deze patiënten kunnen wel behandeld worden met een monoklonale antilichaam dat gericht is op de HER2 eiwitten.
De afdeling Interne Oncologie in het Erasmus MC te Rotterdam heeft onderzoek gedaan naar de HER2/ERBB2 status in formaline gefixeerd in paraffine ingebed (FFPE) en vers ingevroren (FF) klinische monsters. Dit is gedaan met behulp van een immunohistochemie (IHC) op een ‘Tissue Micro Array’ (TMA), aangevuld met ‘fluorescence in situ hybridization’ (FISH) indien nodig, en een kwantitatieve reverse transcriptase ‘polymerase chain reaction’ (RT-qPCR). Hieruit is gebleken dat 26 klinische monsters een discrepante uitslag gaven. Het doel van dit onderzoek was om deze discrepanties te verklaren door gen expressies te meten in RNA geïsoleerd uit FFPE en FF weefsels. Naast de RT-qPCR is RNA ook gemeten met de RNA in situ hybridisatie (RNA-ISH).
Materialen en methoden: De n=10 weefselblokjes die gebruikt zijn voor dit project gaven een discrepante uitslag op grond van de IHC-TMA op FFPE en de RT-qPCR op FF. Alle geselecteerde tumoren waren primaire borsttumoren en zijn in dit onderzoek getest met een aangepaste RT-qPCR, geschikt voor FFPE, om de HER2 status op grond van mRNA in hetzelfde materiaal gebruikt voor de IHC-TMA te bepalen. Van de weefselblokjes zijn coupes gesneden voor een Haematoxyline eosine kleuring (HE). De HE coupes zijn gescreend door onze patholoog. Na de screening is bij het snijden van de coupes een macrodissectie uitgevoerd (verrijking van tumorcellen) voor zowel RNA als DNA isolaties. Na de isolatie zijn verschillende kwaliteit- en kwantiteitcontroles uitgevoerd. Verschillende cut-offs zijn gebruikt om zeker te weten dat het materiaal van voldoende kwaliteit was. Voor de daadwerkelijke meting van de ERBB2 expressie op mRNA niveau is de RT-qPCR geoptimaliseerd met behulp van cellijnen waarvan de HER2 status bekend was. De verkregen data van de cellijnen zijn, samen met de IHC-TMA resultaten, gebruikt als referentie voor de meting van de klinische monsters middels RT-qPCR en RNA-ISH.
Resultaten: In voorgaande onderzoeken (Daane M, 2013, Weekhout M, 2012) zijn statistische testen uitgevoerd om verschillende kwaliteit cut-off waardes te bepalen (leeftijd van de weefselblokjes, minimale input totaal RNA, RNA fragmentgrootte en percentage invasieve tumorcellen (%TC). Na de macrodissectie gaven 3 van de 4 monsters een verandering in genexpressie in de verrijkte tumorcel fractie, hetgeen voor 2 monsters in een andere HER2 status resulteerde. Na deze waarneming is de cut-off waarde van de invasieve tumorcellen verhoogd van 30% naar 60%. Met deze cut-off waardes kon een selectie van n=13 goede monsters gemaakt worden, waarvan de IHC-TMA HER2-status bekend was (voor 1 monster dat op 2 verschillende TMA’s was getest, werden verschillende waarden geconstateerd). De cut-off waarde van de ERBB2 resultaten is bepaald door middel van de positieve voorspellende waarde (PPV) op deze n=13 monsters waar zowel IHC-TMA als RT-qPCR data van beschikbaar waren. Hierbij is de IHC-TMA als gouden standaard gebruikt. Resultaten van een experiment, waarin de HER2-status in FF en FFPE monsters van dezelfde patiënten werd gemeten, lieten zien dat de ERBB2 status van positief in FF naar negatief in FFPE veranderde in 2 van de 5 geteste klinische monsters. Bij één monster verandert de ERBB2 status van negatief naar positief. De RNA-ISH kwam voor slechts 44,4% (4/9) van de geteste monsters overeen met de TMA en voor 44,4% (4/9) met de RT-qPCR. Dit heeft er niet toe geleid dat we meer discrepante uitslagen tussen de IHC-TMA op FFPE en RT-qPCR op FF konden verklaren.
Conclusie: Met de verkregen resultaten kunnen de uitslagen van de discrepante monsters wat betreft de HER2 status grotendeels worden verklaard door 1) verschillen in de FF en FFPE RT-qPCR uitslagen en verschillen in de uitslagen tussen dezelfde monsters opgenomen in verschillende TMA’s (technische fouten), 2) verschillen in de gebruikte uitgangsweefsels, en 3) door uitvoering van de RT-qPCR op materiaal dat nog (te) veel normaal weefsel bevatte (biologische verschillen). Uit de verkregen resultaten kan geconcludeerd worden dat een goede kwaliteitscontrole van het uitgangsmateriaal op grond van vooraf gestelde cut-offs, meenemen van een controlemonster om de uitvoering van de meetmethode te controleren, alsmede macrodissectie voor tumoren met weinig tumorcellen, belangrijk is om de ERBB2 status in de tumorcellen met behulp van RT-qPCR correct te kunnen bepalen.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersErasmus MC
Datum2014-03-24
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk