De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Optimalisatie van kwalitatieve respiratoire real-time reverse transcriptase PCRs op een Roche FLOW semiautomatisch systeem

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Optimalisatie van kwalitatieve respiratoire real-time reverse transcriptase PCRs op een Roche FLOW semiautomatisch systeem

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

De werkgroep moleculaire diagnostiek van de afdeling Viroscience van het Erasmus MC heeft, net als de afdeling zelf, een hoge kwaliteitsstandaard en streeft ernaar deze te bewaren. Hiervoor is de werkgroep onder andere zoekende naar verbeteringen van bepalingen voor PCR, zo ook voor de PCR bepalingen van respiratoire virussen. De Roche FLOW lijn kan hier hulp bieden omdat deze in staat is bepaalde taken van analisten te automatiseren. De lijn is in feite een semi-geautomatiseerde straat waarmee monsters voor PCR kunnen worden voorbereid en verwerkt.
De monsters verdacht van respiratoire virussen waar de afdeling PCR bepalingen op uit moet voeren worden vooralsnog met een MagNA Pure LC (Roche) geïsoleerd en kunnen mogelijk worden overgezet naar de Roche FLOW methode. Met deze nieuwe methode wordt de isolatie uitgevoerd door een MagNA Pure 96 (Roche) en veranderd het input volume van de isolatie. Waardoor het reactievolume van de Real-Time PCR bepalingen omlaag gebracht kan worden. Hierdoor moeten monsters in plaats van 3 maal nog maar 1 maal geïsoleerd worden om getest te worden op aanwezigheid van alle respiratoire targets. Ook kan hierdoor mogelijk gebruik gemaakt gaan worden van 384 wells PCR platen, waardoor 4 maal zoveel bepalingen per run mogelijk worden. Om deze nieuwe methode te valideren moet voldaan worden aan een aantal kritische parameters. De benodigde kritische parameters zijn getest. Zo werd de lineariteit van de PCR reacties in het lineaire gebied van de twee methoden vergeleken door PCR bepalingen op een 1log verdunningsreeks(n=6) van alle respiratoire virussen uit te voeren. Ook werd de gevoeligheid van de PCR reacties bij lage concentraties van de twee methoden vergeleken door een PCR bepaling op een 0,5log verdunningsreeks(n=8) van alle respiratoire virussen uit te voeren. Bij de nieuwe methode werd een reactievolume gebruikt wat ten opzichte van de oude methode 2,5x kleiner was. Daarna werd een multiplex PCR reactie met de respiratoire DNA targets Boca, Adeno en PhHV opgezet. Daarvoor werd eerst de lineariteit en gevoeligheid bepaald, waarna nog een hoog-laag experiment voor beide targets en een genotype inclusiviteits test voor 51 verschillende Adeno stammen werden uitgevoerd. Omdat de reactievolumes van alle respiratoire targets kleiner waren bij de nieuwe methode werd de juistheid van het 384 wells PCR plaat format getest. Op het 384 wells PCR plaat format is ook de pre-klinische validatie van zowel Adeno als Boca uitgevoerd.
De lineariteit van de PCR bepalingen was bij alle targets behalve Parainfluenza 4 vergelijkbaar. De Real-Time PCR efficiency, een manier om lineariteit uit te drukken, was bij Parainfluenza 4 bij de oude methode 121,53% en bij de nieuwe methode 84,31%. De lineariteitsbepaling van PIV4 werd echter goed bevonden omdat de ondergrens op 77% was gesteld. Verder werd bij de nieuwe methode bij alle targets ten opzichte van de oude methode een stijging in fluorescentie gemeten (gemiddelde delta fluorescentie 10,6(bereik 3 - 30)) en een verlaging van de Ct-waarde (gemiddelde delta Ct 2,7(bereik 0,1 – 4,8)). De gevoeligheid was bij de targets Parainfluenza 4, Rhinovirus, HCoV-229E, RSV-B en Rubella verbeterd. Bij HMPV, Influenza A en B, Parainfluenza 1 en 3, Bof, RSV-A, HCoV-NL63, Bocavirus en Adenovirus vergelijkbaar. HCoV-OC43 en Parainfluenza 2 bleken weliswaar minder gevoelig echter bleef dit binnen het gestelde verschil in aantoonbaarheid van 1 verdunning (0,5 log). Bij de genotype inclusiviteits test van Adeno waren alle genotypen detecteerbaar, enkel type 18 werd, met een Ct van 4,7 hoger, minder goed aangetoond. Alle andere typen werden met een vergelijkbare of lagere Ct-waarde aangetoond(gemiddelde delta Ct 3,12(bereik -4,70 – 20,35)). Het 384 wells PCR plaat format gaf bij alle geteste positieve controles bij de verschillende experimenten een positief resultaat, echter is een bepaling van Parainfluenza 3 negatief vanwege een fout in het programma van de PCR set-up robot waardoor hierbij geen primer/probe mengsel werd toegevoegd.
Bij de pre-klinische validatie van Adeno en Boca op het 384 wells format werden alle positieve monsters aangetoond en waren de negative process control en no template control controles negatief.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersErasmusMC Rotterdam, Viroscience
Datum2014-08-19
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk