De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

Methodevalidatie van de moleculair biologische detectie van Guignardia citricarpa in lesies van citrusvruchten middels real-time PCR

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Methodevalidatie van de moleculair biologische detectie van Guignardia citricarpa in lesies van citrusvruchten middels real-time PCR

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

In dit validatierapport zijn de resultaten van de methodevalidatie voor de detectie van Guignardia
citricarpa in citrusvruchten middels real-time PCR beschreven. Er zijn verschillende experimenten
uitgevoerd voor het vaststellen van de prestatiekenmerken: aantoonbaarheidsgrens, analytische
specificiteit, juistheid, selectiviteit, herhaalbaarheid, reproduceerbaarheid en robuustheid.
Voor het bepalen van de aantoonbaarheidsgrens zijn verdunningen gemaakt van acht extracten van
G. citricarpa geïnfecteerde lesies van Citrus sinensis in extract van schil van gezonde sinaasappels.
Hierbij kon een relatieve besmettingsgraad van 1,6% met een betrouwbaarheid van 99,7%
aangetoond worden.
Binnen dit onderzoek is de analytische specificiteit bepaald over drie reinculturen van target en 50
reinculturen van non-target organismen uit geografisch verschillende gebieden. De 50 reinculturen
hebben een negatief signaal in de real-time PCR gegeven en middels een generieke Internal
Transcribed Spacer (ITS) PCR is aangetoond dat amplificeerbaar DNA aanwezig was. De overige drie
monsters hebben een positief signaal gegeven in de real-time PCR. De in silico analytische specificiteit
is bepaald door sequenties van de 50 reinculturen te generen. Op basis van de hechting van de GcF1
(forward primer), GcR1 (reverse primer) en GcP1 (TaqMan probe) op G. citricarpa is een alignment
gemaakt. Hieruit is gebleken dat de primers en de probe specifiek zijn voor de detectie van
G. citricarpa en aspecifiek voor detectie van non-target species.
Over de specifciteitsmonsters is de juistheid (diagnostische specificiteit en diagnostische sensitiviteit)
vastgesteld op 100%. Er zijn geen vals-negatieve en vals-positieve resultaten gegenereerd.
De selectiviteit is bepaald door in drievoud (hoge, gemiddelde en lage concentratie) verschillende
matrices, te spiken met 1 cm2 mycelium van G. citricarpa. Alle monsters van de verschillende
matrices, Citrus aurantifolia (limoen), Citrus × tangelo (mineola), Citrus × paradise (grapefruit),
Citrus limon (citroen), Citrus maxima (pomelo) en Citrus reticulate (mandarijn), waren positief in de
real-time PCR. De gemiddelde ΔCt-waarden bij verschillende relatieve besmettingsgraden in extract
van gezonde schil van citrusvruchten zijn voor de hoge besmetting 1,3, voor de gemiddelde
besmetting 5,0 en voor de lage besmetting 1,7. De hoge ΔCt-waarde van de gemiddelde relatieve
besmettingsgraad is veroorzaakt door een uitschieter in de matrix “extractiebuffer”. Uit de
ΔCt-waarden is gebleken dat er geen sprake is van een matrixeffect.
Op acht verschillende toetsmomenten is de herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid van acht
verschillende monsters variërend in een hoge, gemiddelde en lage concentratie G. citricarpa van drie
verschillende reinculturen bepaald. Alle getoetste verdunningen hebben een overeenkomstige
positieve uitslag gegeven. De Ct-waarden vallen binnen het gemiddelde +/- 2 standaarddeviaties
(SD), waarden welke buiten het gemiddelde +/- 3 SD vallen worden als uitbijter beschouwd. De
herhaalbaarheid en reproduceerbaarheid beide waarden geleverd die 100% conform zijn.
Voor het bepalen van de robuustheid zijn verschillende stappen in de voorbewerking en alternatieve
real-time PCR platforms met elkaar vergeleken: 1. Behandeling van het uitgangsmateriaal (behandeld
met 1% natriumhypochloriet versus onbehandeld), 2. het maaleffect van het monster (kleine beads
versus grote beads), 3. handmatige versus geautomatiseerde DNA isolatiemethode 4. Life
Technologies (7900HT) versus Bio-Rad CFX96. Acht halve lesies zijn zowel behandeld als onbehandeld
met 1% natriumhypochloriet getoetst middels de real-time PCR. Alle monsters geven een positief
signaal. De Ct-waarden laten zien dat er geen significant verschil is tussen de beide behandelingen.
Acht halve lesies zijn getoetst met een grote Tissuelyser bead en acht halve lesies zijn getoetst met
tien kleine Tissuelyser beads. Op basis van de Ct-waarden kan geconcludeerd worden dat een
voorbehandeling met 10 kleine beads een significant lagere Ct-waarden geeft dan een
voorbehandeling met één enkele grote bead. Acht monsters geïsoleerd met de DNeasy Plant Mini kit
en met de QuickPick Plant DNA kit zijn positief bevonden. De isolatie met de QIAcube heeft voor twee
monsters een negatief signaal in de real-time PCR gegeven. Echter om een conclusie hieruit te
trekken moeten er eerst meerdere monsters onderzocht worden. Tot slot is het ABI PRISM® 7900HT
Sequence Detection System van Life Technologies (7900HT) is vergeleken met de CFX96TM real-time
PCR detection system van Bio-Rad (CFX96). Op basis van de resultaten kan geconcludeerd worden dat
de twee verschillende real-time PCR platforms vergelijkbare resultaten geven.
Op basis van deze resultaten kan geconcludeerd worden dat de real-time PCR een betrouwbare en
snelle toets is voor het routinematig testen van monsters op de aanwezigheid van G. citricarpa in
lesies van citrusvruchten.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
InstituutATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersNederlandse Voedsel- en Warenautoriteit
Datum2013-07-01
TypeBachelorscriptie
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 25 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk