De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

In vitro assays to determine chronotype

Rechten: Alle rechten voorbehouden

In vitro assays to determine chronotype

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

The circadian clock is an endogenous biological timing system which is present in all organisms. In mammals, the circadian clock is located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) in the hypothalamus. This master clock generates self-sustained rhythm with a period of about 242 hours. The SCN clock is daily reset by light in order to keep pace with the day/night cycle. The SCN sends signals (hormones and neuronal signals) to peripheral clocks in almost all cells and tissues. The circadian clock can also be monitored in cluttered cells, and the amplitude and period of the oscillation can be determined. However, to determine the chronotype, which represents the behavior and desired time of sleep in a 24-hour light/dark cycle, the phase of entrainment needs to be determined. It is important to develop tools to determine the chronotype in vitro, this information can be used to further analyze the relation between chronotype and health.

By introducing melanopsin into cells grown in vitro, these can be entrained by light which makes it possible to determine the phase of entrainment (this is not detectable with a one-time synchronization cue). This information can help verifying the chronotype, which can possibly help in diagnosing people who have extreme chronotypes and might therefore suffer from Delayed Sleep Phase Syndrome (DSPS) or Advanced Sleep Phase Syndrome (ASPS). The verification of the chronotype from a very early stage (newborns) can be used in the Generation R studies (focus on growth, development and health from fetal life to young adult), here the chronotype can be monitored over the years and the relation between chronotype and illnesses can be determined.

Melanopsin was transiently introduced into MRC5 human fibroblasts and MCF7 human tumor cells after which clones were made, to obtain cell lines stably expressing melanopsin. Western Blot analysis on the population of MRC5 cells did not show expression of the melanopsin protein, while MCF7 cells did express the melanopsin protein. The populations were entrained by light, the MRC5 cells showed an oscillation when kept in dark conditions but no oscillation was observed when entrained by daily light pulses. The MCF7 cells showed an oscillation when kept in dark conditions and when entrained by daily light pulses.

Next, clones of the MRC5 and MCF7 cell line stably expressing melanopsin will be analyzed for the presence of the melanopsin protein with Western Blot analysis. Cells will be entrained by light and kept in dark conditions (negative control) to determine the possible presence of an oscillation. Also more research into hMSCs needs to be conducted by analyzing more antibodies and the possibility of these cells to differentiate, which will attribute to the evidence that mesenchymal stem cells are derived from the Wharton’s Jelly. Melanopsin will be introduced into these cells and entrained by light to possibly obtain an oscillation.

Human mesenchymal stem cells (hMSCs) can be reproducibly derived from the Wharton’s jelly of umbilical cords. These cells express matrix receptor CD44 and integrin CD29 while these lack expression of hematopoietic lineage marker CD45, which represent the expression pattern for mesenchymal stem cells. When these Bmal1::luc was transiently introduced into these cells and synchronized with either 0.1µM dexamethasone, 10µM forskolin or 50% FCS shock no oscillation was observed.


Samenvatting
De circadiane klok is een endogeen biologisch tijdsysteem aanwezig is alle organismes. In zoogdieren, de circadiane klok is gelokaliseerd in de suprachiasmatische nucleus (SCN) in de hypothalamus. Deze centrale klok genereert een zelf-onderhoudend ritme met een periode van ongeveer 24 uur. De SCN klok is dagelijks reset door licht om de dag/nacht cyclus bij te houden. De SCN stuurt signalen (hormonale en neuronale signalen) naar perifere klokken in bijna alle cellen en weefsels. De circadiane klok kan ook gecontroleerd worden in cellen, en de amplitude en periode van de oscillatie kan bepaald worden. Maar, om het chronotype te bepalen, deze representeert het gedrag en voorkeur van tijd om te gaan slapen in een 24-uur licht/donker cyclus, moet de fase van entrainment bepaald worden. Het is belangrijk om methodes te ontwikkelen waarbij het chronotype in vitro bepaald kan worden, deze informatie kan gebruik worden in verdere analyses in de relatie tussen chronotype en gezondheid.

Wanneer melanopsine geïntroduceerd wordt in cellen in vitro, kunnen deze cellen gereset worden met behulp van licht zodat de fase van entrainment bepaald kan worden (dit kan niet bepaald worden door middel van een eenmalige synchronisatie signaal). Deze informatie kan helpen bij het verifiëren van het chronotype, wat kan helpen in het stellen van een diagnose bij mensen met extreme chronotypes en hierdoor mogelijk lijden aan ‘Delayed Sleep Phase syndrome (DSPS)’ of ‘Advanced Sleep Phase syndrome (ASPS)’. Wanneer het chronotype vroeg bepaald kan worden (bij pasgeborene), kan dit gebruikt worden in de Generation R studie (focus op groei, ontwikkeling en gezondheid van geboorte tot adolescentie), hierbij kan het chronotype gemonitord worden door de jaren heen en de relatie tussen chronotype en ziektes bepaald worden.

Melanopsine was transient geïntroduceerd in MRC5 menselijke fibroblasten en MCF7 menselijke tumor cellen, waarna klonen gemaakt zijn zodat cellijnen verkregen konden worden die stabiel melanopsine tot expressie brengen. Western Blot analyse op de populatie van MRC5 cellen gaf geen expressie van het melanopsine eiwit, terwijl MCF7 cellen dit eiwit wel tot expressie brachten. De populaties waren gereset met behulp van licht, MRC5 cellen hadden een oscillatie in donkere condities, maar niet wanneer deze gereset waren met behulp van dagelijkse licht pulsen. De MCF7 cellen hadden een oscillatie zowel in donkere condities als wanneer deze gereset waren met dagelijkse light pulsen.

Hierna zullen de klonen van de MRC5 en MCF7 cellen die stabiel melanopsine tot expressie brengen geanalyseerd worden voor de aanwezigheid van het melanopsine eiwit met behulp van Western blot analyse. De cellen zullen gereset worden met behulp van licht en als negatieve controle ook in donkere condities gehouden worden om mogelijk een oscillatie aan te tonen. Ook zal er meer onderzoek gedaan worden naar menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) waarbij meer antilichamen geanalyseerd zullen worden en de mogelijkheid van deze cellen om te differentiëren. Dit zal bijdragen aan het bewijs dat de cellen uit het Wharton’s Jelly daadwerkelijk mesenchymale stamcellen zijn. Melanopsine zal ook hierbij geïntroduceerd worden in de cellen en gereset door light waarbij mogelijk een oscillatie verkregen kan worden.

Menselijke mesenchymale stamcellen (hMSC) kunnen reproduceerbaar verkregen worden uit het Wharton’s Jelly van navelstrengen. Deze cellen brengen matrix receptor CD44 en integrine CD29 tot expressie, waarbij de expressie van de hematopoietische marker CD45 niet aanwezig is wat het expressie patroon van mesenchymale stamcellen representeert. Bij het transient introduceren van Bmal1::luc in deze cellen en synchroniseren met behulp van ofwel 0.1µM dexamethason, 10µM forskoline of een 50% FCS shock wordt er geen oscillatie geobserveerd.

Toon meer
OrganisatieAvans Hogeschool
OpleidingBiologie en Medisch Laboratoriumonderzoek-Breda
AfdelingATGM Academie voor de technologie van Gezondheid en Milieu
PartnersErasmus MC
Jaar2016
TypeBachelor
TaalEngels

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk