Samenvatting

Momenteel is eenderde van de wereldbevolking besmet met M. tuberculosis, worden er 8 miljoen nieuwe gevallen per jaar ontdekt en sterven er per jaar 2 miljoen mensen aan deze ziekte. Dit maakt TBC de meest voorkomende doodsoorzaak ten gevolge van een infectie. Mycobacteriën groeien langzaam, waardoor het lang duurt voordat de kweekuitslag bekend is. Daarom wordt er naast de kweek ook een moleculaire test (Cobas) ingezet, die MTB-complex DNA aantoont. Wanneer van een materiaal de amplificatie geremd is in de Cobas, wordt deze 1:10 verdunt en nogmaals bepaald. Omdat de test maar één keer in de week wordt uitgevoerd moet men soms lang wachten op resultaat. Daarom is er onderzoek gedaan naar een alternatieve moleculaire test, om de Cobas eventueel te vervangen, die beter in de routine inpasbaar is. Ook is er gekeken naar een test die alle Mycobacteriën zou moeten detecteren (Myc. genus PCR). In dit onderzoek werd bovendien gekeken naar verschillende DNA isolatie methodes.

Er zijn verschillende voorbehandelingsmethodes (NALC-NaOH, DTT, MagNAlyser, Proteïnase-K-buffer, S.T.A.R. buffer en onbehandeld sputum) onderzocht om materiaal vloeibaar te maken. Sputa die behandeld zijn met NALC-NaOH, MagNA lyser of met DTT hebben vergelijkbare resultaten in de MTB-complex PCR, maar verschillen in de Myc. genus PCR. In de Myc. genus PCR is bij sputa die met NALC-NaOH zijn behandeld meer DNA aangetoond dan bij de andere voorbehandelingsmethodes. Tevens vindt er veel remming van de PCR plaats bij onbehandelde sputa en sputa die met DTT, MagNAlyser of met proteïnase-K-buffer zijn behandeld. De beste methode is dus NALC-NaOH. Er zijn verschillende methodes onderzocht om DNA te isoleren: de MagNA Pure in combinatie met een DNA-kit of TNA kit, MagNA Pure compact en Silica-membranen. De MagNA Pure in combinatie met de DNA-kit is het meest geschikt om DNA van Mycobacteriën te isoleren, omdat deze combinatie de hoogste DNA-opbrengst geeft.

Vervolgens wordt het MTB-complex DNA en het DNA van Mycobacteriën gedetecteerd met behulp van een op een Taqman gebaseerde test. Deze alternatieve test is klinisch gevalideerd door hem parallel te draaien met de reeds in gebruik zijnde Cobas test. Hiervoor zijn er 593 materialen getest op aanwezigheid van het MTB-complex DNA. Het aantal materialen dat bij een eerste bepaling remming geeft, ligt bij de Cobas hoger, maar het uiteindelijke aantal remmers is bij beide methodes ongeveer gelijk. Om het aantal remmers bij de Taqman te verminderen, kan men in plaats van het materiaal nog een keer zuiveren ook, het materiaal verdunnen en dan bepalen, net zoals bij de Cobas. Er blijkt dat het 1:5 verdunnen van het geremde materiaal het aantal remmers in de PCR kan verminderen. De PCR heeft bij 47 materialen DNA van het MTB-complex aangetoond, terwijl de Cobas dit slechts bij 23 materialen heeft aangetoond. Bij een tweede bepaling van deze materialen in de PCR is bij 12 van de 24 materialen wederom MTB-complex DNA aangetoond. De andere materialen zouden besmet kunnen zijn tijdens de DNA isolatie in de MagNA Pure. Van deze 12 materialen is bij vier materialen M. tuberculosis gekweekt en is één materiaal afkomstig van een patiënt die in het verleden een TB-infectie heeft gehad. Mogelijk zaten er dode Mycobacteriën in het materiaal, die door de PCR zijn gedetecteerd. De andere positieven kunnen duiden op een besmetting tijdens NALC-NaOH en/of voorbehandeling, omdat deze worden uitgevoerd in een LAF-kast waarin ook positieve kweken worden geopend. Naast het aantonen van het MTB-complex zijn er ook 394 materialen getest op aanwezigheid van DNA van Mycobacteriën met behulp van de Taqman.
Het verkregen resultaat is vergeleken met de kweekuitslag. De PCR heeft bij veel materialen DNA van Mycobacteriën aangetoond, terwijl er geen Mycobacteriën gekweekt zijn. Deze PCR is kwalitatief niet goed, omdat Corynebacteriën ook gedetecteerd worden. Uiteindelijk is er besloten om niet meer door de te gaan met de Myc. genus PCR.