Samenvatting

Het doel van dit afstudeeronderzoek was het optimaliseren, valideren en implementeren van de dermatofyten Polymerase Chain Reaction (PCR) voor het real-time PCR apparaat LightCycler 480. De detectie van de dermatofyten vindt plaats door middel van de amplificiatiecurve en de determinatie gebeurt aan de hand van een smeltcurve-analyse.
Het overzetten van de PCR van de LightCycler 2.0 naar de LightCycler 480 was nodig omdat de huidige dermatofyten PCR op de LightCycler 2.0:
- Onvoldoende capaciteit heeft (32 monsters/run)
- Gebruikt maakt van dure reagentia (Multiplex Master Hyb.)
- Werkt met glazen capillairen die erg breekbaar en duur zijn
De LC480 werkt met een plastic 96 wells plaat en heeft goedkopere master mix.

De aanpassingen die voor het overzetten van de dermatofyten PCR van de LightCycler 2.0 naar de LightCycler 480 nodig waren, zijn;
-- De interne controle en Epidermophyton floccosum moesten worden overgezet naar een ander detectiekanaal. Daarvoor hebben de probes van beide targets een ander fluorescentielabel gekregen. De probe voor de interne controle is met een 610 label gelabeld en Epidermophyton floccosum met een 660 label. Ook is de probe van de interne controle langer gemaakt om de Tm curve ten opzichte van Microsporum canis te verhogen.
- In de LightCycler 480 kwamen de Tm curven van de species Trichophyton rubrum en Trichophyton violaceum te dicht op elkaar te liggen, waardoor deze niet goed van elkaar te onderscheiden waren. Om dit de verhelpen is de acceptor probe voor Trichophyton rubrum en violaceum, met zes basen verlengd, zodat er twee basen verschilde met de probe in plaats van één waardoor de Tm curven van deze species beter van elkaar te onderscheiden waren.
Ter validatie is de Tm-range per dermatofyt bepaald