Samenvatting

Enterokokken zijn commensalen van het gastro-intestinale stelsel bij mens en dier. Enterokokken nosocomiale infecties worden meestal veroorzaakt door E. faecalis & E. faecium. 10% van deze infecties worden veroorzaakt door E. faecium. Enterokokken, en in het bijzonder E. faecium, zijn resistent voor een groot aantal antibiotica. E. faecium kunnen resistentiegenen uit hun omgeving opnemen door o.a. horizontaal gen overdracht. Conjugatie is de belangrijkste vorm van horizontaal gen overdracht.

Uit een eerder onderzoek naar de populatie structuur van E. faecium is gebleken dat epidemische isolaten en de meeste klinische isolaten samen clusteren in het clonal complex-17 (CC17). E.faecium CC17 stammen worden gekenmerkt doordat ze resistent zijn voor ampicilline en chinolonen; en de aanwezigheid van een op een pathogeniciteits eiland (PAI) gelegen enterococcal surface protein (esp) – gen. Het esp gen is betrokken bij de biofilm formatie. Het PAI van E. faecium heeft een grootte van 58 kb.

Het eerste doel van dit onderzoek was de functie van een ander op het PAI gelegen gen, orf5 te bestuderen. De sequentie van orf5 komt overeen met peptidoglycaan hydrolases, N-acetylmuramidases, en autolysines van E. faecalis, E. hirae, Lactococcus lactis, en S. pyogenes. Peptidoglycaan hydrolase zijn verantwoordelijk voor een aantal belangrijke biologische functies zoals celwand groei, celdeling, bacteriolysine. In E. hirae zijn er 2 soorten muramidase beschreven. Muramidase-1 is gesynthetiseerd in latente vorm en wordt later door trypsine in een actieve vorm geconverteerd. Het tweede enzym, muramidase-2, wordt tijdens de celdeling in vloeibaar medium uigescheiden en heeft 2 actieve vormen: 125 kDA en 75 kDA. De sequentie van orf5 van het E. faecium PAI komt overeen met de sequentie van de muramidase-2 van E. hirae.

Het is niet duidelijk of dit muramidase (mur) voor muramidase activiteit of voor autolysine activiteit codeert, daarom werden zowel een muramidase als autolysine assay opgezet. Bij muramidase activiteit wordt de peptidoglycaanlaag van de celwand van een bacterie opgelost. Bij autolysine komt DNA vrij doordat de cellen worden gelyseerd. Om te bevestigen dat deze mogelijke activiteiten ook werkelijk door het mur gen werd veroorzaakt, moest eerst een insertie-deletie mutant van het mur gen in een klinisch isolaat E1162 (E1162∆mur) worden gemaakt. Hierbij werd een chlooramphenicol gencassette in het mur gen gekloneerd.

Het construeren van een insertie-deletie mutant van het mur gen is niet gelukt. Na de transformatie van de recombinante vector naar de E1162, zat de recombinante vector los in de cel i.p.v. in het genoom gaan integreren. Het opzetten van functionele assays voor muramidase zijn voortgezet ondanks dat de klonering van het gen muramidase niet is gelukt. Over het algemeen is geen muramidase activiteit maar wel autolysine activiteit waargenomen in de stam E1162WT en de esp mutant (E1162∆esp). De resultaten van deze twee assays waren niet reproduceerbaar. Een muramidase-mutant is essentieel voor deze functionele assays.