Samenvatting

Clostridium difficile is een anaërobe Gram-positieve staaf, die sporen kan vormen. Deze bacterie kan milde diaree, pseudomembraneuze colitis en toxinogene megacolon veroorzaken. Deze ziektebeelden worden samengevat als C. difficile infectie (CDI). C. difficile kan drie toxinen produceren: toxine A, toxine B en een binair toxine. Toxine A en toxine B veroorzaken diarree en beschadigingen in de dikke darm. De functie van het binaire toxine in infectie met C. difficile is nog niet bekend.

Op het LUMC is een real-time toxine B-PCR (real-time toxB-PCR) ontwikkeld. Hierbij wordt feces voorbehandeld met STAR-buffer en het DNA wordt automatisch geïsoleerd met de MagNA Pure LC. Met verschillende voorbehandelings- en DNA-isolatie methoden is geprobeerd deze toxB-PCR te optimaliseren. Echter werd geen verbetering van de sensitiviteit waargenomen t.o.v. de ontwikkelde methode. Het doel van dit onderzoek was het verbeteren van de sensitiviteit van de real-time toxBPCR bij feces met behulp van looxster® en een specifiek aankweekmedium. Looxster® is een methode waarbij prokaryoot DNA wordt geconcentreerd. Het specifieke aankweekmedium bevatte cycloserine, cefoxitine, taurocholaat en lysozym. De eerste twee zijn antibiotica en remmen de groei van Enterobacteriaceae. De laatste twee genoemde stoffen zorgen ervoor dat sporen van C. difficile kunnen ontkiemen. Uit de resultaten bleek dat zowel looxster® als het specifiek ontwikkelde aankweekmedium geen verbetering gaf van sensitiviteit van de real-time toxB-PCR bij feces. Omdat bij gebruik van het specifiek ontwikkelde aankweekmedium geen verbetering van de real-time toxB PCR bij feces werd gevonden, werd besloten de groei van C. difficile in dit medium te onderzoeken zonder feces. Hieruit bleek dat de groei van C. difficile in het specifieke aankweekmedium niet reproduceerbaar was. Om deze reden werd onderzocht in welk medium C. difficile wel goed wilde groeien. Vier verschillende aankweekmedia werden bij dit experiment onderzocht: het specifieke aankweekmedium (BHI+CCTL), Thio, TSB+XV en BHI. Uit de resultaten bleek dat de bacterie in het medium thio het beste groeide. Daarom wordt geprobeerd de rt toxB-PCR te optimaliseren met het medium thio dat cycloserine en cefoxitine bevat en verschillende concentraties taurocholaat en lysozym.

De virulentiefactoren van C. difficile zijn onderzocht in ribotype 078-stammen op basis van PCR. Deze virulentiefactoren zijn het tcdA-gen, tcdB-gen, tcdC-gen, die liggen op het pathogeniciteitslocus (PaLoc) en cdtA-gen en cdtB-gen, die liggen op het cytolethal distending toxine locus (CdtLoc). Daarnaast werd een deel van het tcdC-gen gesequenced en werd een PCR uitgevoerd op het ErmB-gen. Het doel was om een relatie aan te kunnen tonen tussen ribotype 078-stammen afkomstig van mens en varken op basis van de virulentiefactoren. Ribotype 078-stammen uit verschillende jaargangen (2005-2007) zijn ook onderzocht om eventueel te kunnen verklaren waarom dit ribotype de laatste jaren toeneemt. Tevens is onderzocht wat de verschillen zijn tussen gekarakteriseerde ribotype 078-stammen en de referentiestam ribotype 027. Uit de resultaten bleek dat de gekarakteriseerde ribotype 078-stammen van humane- en varkensafkomst dezelfde virulentiefactoren (tcdA, tcdB, cdtA en cdtB) hadden. Het tcdC-gen bevatte bij de ribotype 078-stammen puntmutaties op positie 183bp en 184bp. De mutatie op positie 184bp resulteert in een vroegtijdig stopcodon. Daarnaast hadden alle gekarakteriseerde ribotype 078-stammen een 39bp deletie in het tcdC-gen. Alle gekarakteriseerde C. difficile ribotype 078-stammen hadden ook dezelfde bekende virulentiefactoren als de zeer virulente C. difficile ribotype 027. Het tcdC-gen van ribotype 027 heeft een puntdeletie, waardoor door een frameshift verderop in het gen een stopcodon ontstaat. Dus ribotype 078 heeft een andere mutatie in het tcdC-gen dan ribotype 027, maar beide mutaties leiden tot een vroegtijdig stopcodon.