De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk

Terug naar zoekresultatenDeel deze publicatie

RNA interference in muis embryonale stamcellen

Rechten: Alle rechten voorbehouden

RNA interference in muis embryonale stamcellen

Rechten: Alle rechten voorbehouden

Samenvatting

Zowel in muizen als mensen embryonale stamcellen (ESCs) zijn eiwitten geïdentificeerd waar niets bekend van is in de literatuur. Doordat de eiwitten alleen in ESCs zijn ge-vonden door middel van massaspectometrie en niet in gedifferentiëerde cellen is de kans groot dat deze eiwitten te maken hebben met de stamcel behoudende eigenschappen van de ESCs. Om meer over de functie van de ongekarakteriseerde eiwitten te weten te komen werd eerst gekeken hoe de cellen reageren zonder één van de eiwitten. De in dit onderzoek gebruikte manier om de eiwitten in ESCs uit te schakelen is gebaseerd op RNA interference (RNAi).

In dit verslag wordt beschreven hoe RNAi werd toegepast in het Hubrecht Laboratorium voor functioneel onderzoek naar de ongekarakteriseerde eiwitten in muis embryonale stamcellen (mESCs). Van een geselecteerde groep ongekarakteriseerde eiwitten werden oligo’s ontworpen die vanaf de pSilencer 2.0-U6 als short hairpin RNAs (shRNAs) worden afgelezen in mESCs. Het shRNA zal na een aantal reactie stappen een com-plementair stuk messenger RNA (mRNA binden). Door deze binding wordt het mRNA afgebroken waardoor geen nieuwe eiwitten meer aangemaakt kunnen worden in de cel.

Als negatieve controle werd een sequentie meegenomen die geen homologie vertoont met genen in de mens, muis of rat. Deze controle is de “scrambled control”.

Voor de ongekarakteriseerde eiwitten zijn (zover bekend) geen antilichamen beschikbaar. In het onderzoek is er daarom gekeken naar het effect van knock-down (gene silencing) van de ongekarakteriseerde eiwitten op de expressie van de eiwitten Oct4 en Msh6 in mESCs. Oct4 en Msh6 gaven een goed knock-down resultaat wanneer de eiwitexpressie specifiek geïnhibeerd werd, maar als marker voor de ongekarakteriseerde eiwitten bleken ze ongeschikt.

Ook is in dit onderzoek aangetoond dat het enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) gen kan worden afgelezen door RNA polmerase van de pSilencer 2.0-U6 door activatie van de U6 promoter. Deze U6 promoter bevindt zich ook voor de short interference RNA (siRNA) constructen in dezelfde pSilencer 2.0-U6 vector. Op deze manier kunnen in ge-transfecteerde cellen het eGFP en het siRNA met dezelfde activiteit worden gepro-duceerd. Het eGFP eiwit is een eiwit dat door aanstralen met een blauw laser licht een groen licht zal fluoresceren en is daarmee tevens een goede controle voor de transfectie efficiëntie.

Toon meer
OrganisatieHogeschool Utrecht
OpleidingBiologie en Medisch Laboratorium Onderzoek
AfdelingLife Sciences en Chemistry
PartnersHubrecht Laboratorium
Jaar2006
TypeBachelor
TaalNederlands

Op de HBO Kennisbank vind je publicaties van 26 hogescholen

De grootste kennisbank van het HBO

Inspiratie op jouw vakgebied

Vrij toegankelijk