Samenvatting

Colorectaal carcinoom wordt in Nederland bij ruim 9000 mensen per jaar vastgesteld en bijna de helft hiervan overlijdt eraan, vaak omdat de tumor al vergevorderd is. De diagnose vindt plaats door de analyse van bij endoscopisch onderzoek weggenomen weefsel. Colorectaal carcinomen beginnen als poliepen die ontstaan vanuit de epitheliale stamcellen in het maagdarmkanaal. Voor het groeiproces van een goedaardige poliep tot maligne carcinoom zijn meerdere cellulaire mutaties nodig. De pathologie van de tumor wordt geclassificeerd in verschillende stages, afhankelijk van de mate van invasie in de darmwand, de betrokkenheid van lymfeklieren en de mate van metastasering. De behandeling van darmtumoren bestaat uit het chirurgisch verwijderen van de tumor, al dan niet gevolgd door chemotherapie.
Voor het ontstaan van een darmtumor zijn twee genetische routes bekend, de Chromosoom Instabiliteit route en de Microsatelliet Instabiliteit route. De laatste route wordt vooral geassocieerd met heriditary nonpolyposis colorectal cancer, terwijl de eerste route een model is voor familial adenomatous polyposis en sporadische colorectaal carcinomen. Het is een multi-staps model waarin verschillende genen na elkaar muteren. Eén van die genen is het K-ras gen. K-ras is een klein oncogen dat codeert voor een klein eiwit met GTPase-activiteit. Het speelt een rol in de transductie van extracellulaire stimuli naar de celkern. Zo wordt in reactie op externe groeifactoren met behulp van K-ras de cel aangezet tot groei, deling en differentiatie. Wanneer K-ras gemuteerd is geeft ze deze signalen, ongeacht of er externe stimuli zijn, door naar de kern en gaat de cel zich ongeremd delen.
Mutaties in K-ras komen vroeg in de carcinogenese voor en de mutaties bevinden zich voor het merendeel in drie hotspots: in codon 12 en 13 van exon 1 en in codon 61 van exon 2. Vaak wordt het geassocieerd met een slechte prognose, maar het prognostisch karakter van K-ras staat ter discussie. Echter, onderzoek naar screening van risicogroepen met behulp van K-ras mutatie-analyse in faeces is veelbelovend. Ook kan de K-ras mutatie-analyse uitsluiten of bevestigen of er bij een tweede tumor sprake is van een metastase van een primaire tumor, hetgeen van belang is voor de behandeling. Bovendien is de aan- of afwezigheid van K-ras mutaties bij patiënten met niet-kleincellig longcarcinomen van therapeutisch belang. Deze patiënten reageren niet op behandeling met tyrosine kinase inhibitors. Om deze redenen is op het moleculaire pathologie laboratorium van het UMC Utrecht een mutatie-analyse van het K-ras gen ontwikkeld die bruikbaar is voor DNA geïsoleerd uit in paraffine ingebed weefsel.
Er is gekozen voor een methode op basis van PCR en sequentie-analyse. Een genspecifieke PCR voor exon 1 en 2 van K-ras is geoptimaliseerd door te variëren in PCR-primers, annealingstemperatuur, aantal cycli, magnesiumconcentratie, bufferconcentratie en type DNA polymerase. De PCR-producten zijn vervolgens enzymatisch gezuiverd en gesequenced met interne primers. De bepaling is gevalideerd met een aantal monsters met bekende K-ras mutaties. Het resultaat is een gevalideerde diagnostische moleculaire bepaling voor de K-ras mutatie-analyse. De bepaling is reeds uitgevoerd op een eerste casus: de vraag of een ovariumtumor een metastase was van een tumor in de appendix werd bevestigd, dankzij de aanwezigheid van eenzelfde K-ras mutatie in zowel de appendix als in het ovarium.