Samenvatting

De overheid binnen Europa heeft een aantal onafhankelijke controle laboratoria aangewezen om de fabrikanten van vaccins te controleren. In Nederland gebeurt die controle bij het centrum voor Biologische geneesmiddelen en Medische Technologie (BMT) van het Rijksinstituut voor Volksgezondheid en Milieu (RIVM). Een van de producten die BMT controleert is het bof-, mazelen- en rubella (BMR) vaccin. Het gehalte aan levend virus in BMR-vaccins wordt bepaald met behulp van een ‘median cell culture infectious dose’ (CCID50) methode. Hiervoor worden wells met cellen geïnfecteerd met een verdunningsreeks van het vaccin en na 8-10 dagen beoordeeld op de aanwezigheid van cytopathologisch effect (CPE). Omdat er een aantal nadelen aan de test zitten zoals de lange doorlooptijd, de neutralisatie van de niet te bepalen componenten en het moeilijk te beoordelen CPE bij rubella, is er gekeken naar een alternatieve test: de CCID50 real-time RT-PCR. De CCID50 real-time RT-PCR bestaat uit een korte kweekstap van 3 dagen, gevolgd door lysis van de cellen en een detectie van viraal RNA door middel van real-time RT-PCR. Deze test heeft een kortere doorlooptijd, de neutralisatie van de niet te bepalen componenten kan waarschijnlijk achterwege gelaten worden en de wells hoeven niet meer met het oog beoordeeld te worden. Dit verslag beschrijft de ontwikkeling en validatie van de CCID50 real-time RT-PCR methode voor het BMR vaccin.
De real-time RT-PCR voor bof, mazelen en rubella is opgezet en geoptimaliseerd met behulp van RNA-standaarden. Er is gekeken naar de primer- en probe concentratie, het reactievolume, het PCR-programma en de specificiteit van de real-time RT-PCR.
Isolatie van viraal RNA met behulp van de Roche High Pure isolation kit is erg arbeidsintensief, daarom is er gekeken naar een methode met minder hands-on-time. Lysis van de cellen met behulp van triton X-100 in combinatie van een vries-dooi-stap blijkt een goed alternatief. Na het op deze manier vrijmaken van viraal RNA kan er, na een verdunningsstap, een real-time RT-PCR worden uitgevoerd op het cellysaat.
Voor het bepalen van de lengte van de kweekstap zijn er een aantal testen ingezet waarbij het virale RNA na 1, 2, 3, 4 en 7 dagen is vrijgemaakt. Hieruit bleek dat een kweekstap van 3 dagen voldoende is om viraal RNA aan te tonen van zowel bof, mazelen als rubella virus. Nadat de CCID50 real-time RT-PCR voor de 3 componenten uit het BMR-vaccin opgezet was, is een validatie uitgevoerd met monovalente standaard vaccins. Voor de validatie zijn de parameters intrinsieke precisie, intermediaire precisie en de lineariteit en het bereik bepaald. De resultaten van de CCID50 real-time RT-PCR methode komen overeen met de resultaten van de conventionele CCID50 methode.
Ten slotte is met de CCID50 real-time RT-PCR methode ook de CCID50 waarde bepaald van trivalente monsters, samengesteld uit de drie monovalente standaard vaccins. De CCID50 waardes kwamen overeen met die van de monovalente standaard vaccins. Daarom werd geconcludeerd dat bof, mazelen en rubella virus elkaar niet beïnvloeden tijdens een korte kweekstap en dat neutralisatie van niet te bepalen componenten achterwege gelaten kan worden bij het bepalen van de potency van trivalente vaccins met behulp van de CCID50 real-time RT-PCR methode.