Samenvatting

De bacterie Streptococcus pneumoniae is wereldwijd verantwoordelijk voor een hoge morbiditeit en mortaliteit bij zowel kinderen als volwassenen. De risicogroep voor infecties met S. pneumoniae bestaat voornamelijk uit kinderen van 0-5 jaar (in het bijzonder het eerste levensjaar), ouderen en mensen met een verminderde weerstand, zoals aids patiënten, alcoholisten en mensen zonder milt. Infecties met S. pneumoniae zijn te onderscheiden in twee groepen. 1. De mucosale of niet- invasieve infecties (infecties van de slijmvliezen.), zoals otitis media, bronchitis en niet met bacteriëmie gepaard gaande pneumonie. 2. De invasieve infecties, dit zijn met bacteriëmie geassocieerde ziekten, zoals meningitis ernstige sepsis en lobaire pneumonie. S. pneumoniae bezit diverse virulentie factoren. De belangrijkste hiervan is het polysaccharidekapsel van de bacterie. Dit kapsel beschermt de bacterie tegen fagocytose. Daarnaast vindt er aan de hand van dit polysaccharidekapsel ook serotypering van de bacterie plaats. Deze serotypering wordt uitgevoerd met behulp van de Neufeld of Quellung reactie. Deze reactie is gebaseerd op de reactie tussen het kapselpolysaccharideantigeen en specifieke antistoffen. Op basis van deze serotypering worden meer dan 90 verschillende serotypen en serosubtypen onderscheiden. Naast serotypering vindt de typering van S. pneumoniae ook plaats aan de hand van genotypering. Enkele methoden die gebruikt worden voor deze genotypering zijn Multilocus Sequence Typing (MLST) en Multiple-locus Variable Number of Tandem Repeats Analysis (MLVA). Multilocus Sequence Typing is een op sequentie analyse gebaseerde methode, waarin gebruik wordt gemaakt van zeven huishoudgenen die specifiek zijn voor S. pneumoniae. Er is juist gekozen voor deze huishoudgenen, omdat hierin relatief weinig variatie optreedt. De beperkte variatie maakt de huishoudgenen uitermate geschikt voor populatie studies. Van deze zeven genen wordt met behulp van een PCR een fragment van ongeveer 500 bp geamplificeerd. Op deze PCR producten wordt een sequentie analyse uitgevoerd. Zo wordt van ieder van de zeven huishoudgenen een sequentie verkregen, waarvan de samenstelling tussen verschillende bacteriën binnen dezelfde populatie in een bepaalde mate varieert. Elke gevonden variant wordt een allel genoemd. Aan de hand van de 7 bepaalde allelen wordt nu het allelprofiel bepaald. Dit allelprofiel wordt verkort aangeduid met een zogenaamd Sequence Type (ST).
Het doel van het in dit verslag beschreven onderzoek was, de beschikking te krijgen over een typeermethode voor S. pneumoniae die internationaal gehanteerd wordt. Er werd gekozen voor MLST, omdat deze methode internationaal geld als gouden standaard voor de genotypering van S. pneumoniae. Deze MLST diende geoptimaliseerd te worden voor gebruik binnen het laboratorium. Dit omdat de MLST ontworpen is voor gebruik met gezuiverd chromosomaal DNA en er binnen het laboratorium bacterie-lysaten gebruikt worden. Daarnaast wordt de reeds beschreven MLST voor S.pneumoniae uitgevoerd door de zeven huishoudgenen met zeven afzonderlijke PCR reacties te amplificeren. Het streven in dit onderzoek was om de zeven huishoudgenen in één multiplex PCR te amplificeren. Voor deze optimalisatie van de PCR werden de zeven huishoudgenen eerst m.b.v. afzonderlijke PCR reacties geamplificeerd om de opbrengst van de PCR producten m.b.v. de voorgeschreven primers te bepalen. Aan de hand van deze resultaten werden voor een aantal genen nieuwe primers ontworpen. Ook werd de optimale annealing temperatuur van de PCR bepaald. Daarnaast werden m.b.v. GeneScan analyse de opbrengst van de afzonderlijke PCR producten, de optimale hoeveelheid bacterie-lysaat en de optimale primerconcentratie in de multiplex PCR bepaald. Vervolgens werd deze methode geoptimaliseerd om vanuit het mengsel van de producten elk van de huishoudgenen apart te kunnen sequensen. Hiertoe werden de optimale DNA concentratie in de sequence PCR en de optimale zuiveringsmethode bepaald. Met behulp van de geoptimaliseerde multiplex MLST werd vervolgens typering uitgevoerd op 16 controle stammen om de robuustheid van de methode te bepalen. De resultaten van de geoptimaliseerde MLST werden weergegeven m.b.v. een clustering techniek “minimum spanning tree” genaamd. Tot slot werd de methode gebruikt voor de typering van een selectie van 51 controle isolaten met serotype 6 en serotype 9 om een vergelijking te maken tussen de MLST resultaten en die van de eerder bepaalde MLVA m.b.v. dezelfde clustering methode. Hieruit werden de overeenkomsten en de verschillen tussen de beide typeermethoden bepaald. Uit deze vergelijking bleek dat er bij typering met deze beide methoden dezelfde soort clustering optreedt. De MLVA maakt echter meer onderscheid tussen isolaten met hetzelfde serotype.
Uit de verkregen resultaten van dit onderzoek bleek dat het mogelijk is om met de opgezette multiplex PCR al de zeven huishoudgenen te amplificeren. Ook is het mogelijk om vanuit dit multiplex PCR product al deze genen apart te sequencen. Daarnaast is de methode robuust genoeg gebleken voor uitvoering m.b.v. bacterie-lysaten in plaats van gezuiverd chromosomaal DNA. Ook is de multiplex MLST succesvol toegepast voor de typering van een aantal stammen met serotype 6 en serotype 9.
Uit de bovenstaande resultaten kan geconcludeerd worden dat er beschikking is verkregen over een international gehanteerde typeermethode voor Streptococcus pneumoniae, namelijk de multiplex Multilocus Sequence Typing.