Samenvatting

Amplified Fragment Length Polymorphisme (AFLP) is een techniek die gebruikt wordt om DNA fingerprints te maken voor genetisch onderzoek. Op het VUmc word de AFLP gebruikt door de Moleculaire Epidemiologie om te bepalen of patiënten zijn geïnfecteerd met het zelfde genotype pathogeen. Zo kan geconcludeerd worden of twee patiënten elkaar besmet hebben. Op deze manier wordt AFLP toegepast in outbreak management. Tevens voert het VUmc voor externe aanvragers typeringen uit.
De AFLP methodiek is tijdrovend, echter wordt er op het VUmc gewerkt aan optimalisatie en automatisering van de AFLP om deze sneller en meer reproduceerbaar te maken. Onderdeel van dit optimaliseringsproces is de toepassing van MM-Lysis voor DNA isolatie. Voordat deze stap gemaakt kan worden moet de MM-Lysis gevalideerd worden om aan te tonen dat de methodiek betrouwbaar genoeg is.
Om een stam te valideren op MM-Lysis worden uit de database enkele in het verleden gemaakte fingerprints geselecteerd. Deze fingerprints zijn gemaakt met Qiagen kolom DNA extractie en los gepipetteerde reactie mixen voor de restrictie/ligatie en PCR. Voor de validatie wordt opnieuw een fingerprint gemaakt, echter nu met de MM-Lysis methode waarna de PCR wordt uitgevoerd met gestandaardiseerde mastermixen. De clustering en kwaliteit van de nieuwe patronen worden beoordeeld en vergeleken met de oude patronen. Voor een succesvolle validatie moet MM-Lysis een goed patroon opleveren en ≥90% identiek zijn aan hetzelfde monster met Qiagen DNA.
Een aantal stammen is reeds succesvol gevalideerd: E. faecalis, E. faecium, K. oxytoca en K. pneumoniae. C. freundii is na 3 pogingen nog niet succesvol gevalideerd. Uit literatuur blijkt dat dit mogelijk is te wijten aan een aantal specifieke enzymen geproduceerd door C. freundii welke in staat zijn om glycerol af te breken. Onderzoek naar het later toevoegen van MgCl2 heeft goede resultaten op andere stammen gegeven. Mogelijk is C. freundii wel succesvol te valideren wanneer gebruikt word gemaakt van een PCR mastermix met later toegevoegde verhoogde concentratie MgCl2.
Er is veel onderzoek gedaan naar optimalisatie van de ALFP en het produceren van een meer constant resultaat. MgCl2 concentratie in de PCR mastermix lijkt hier een belangrijke rol in te spelen. Er is tijdens het onderzoek gevonden dat een goed AFLP patroon geproduceerd kan worden door MgCl2 later toe te voegen aan een magnesiumvrije mastermix. Wanneer MgCl2 en mastermix apart worden gehouden tot gebruik, kunnen beide ook ingevroren worden zonder kwaliteitsverlies.