Samenvatting

Typeren van Carbapenemase Producerende Enterobacteriaceae op basis van het plasmidoom
Enterobacteriaceae is een familie van gram-negatieve bacteriën. Enterobacteriaceae komen bij de mens voor in de darmflora en leven daar als commensalen. Zij behoren ook tot één van de meest voorkomende ziekteverwekkers bij mensen. Een reden hiervoor is dat er gemakkelijk transmissie plaats vindt door handcontact en geïnfecteerd voedsel- en water.
Het is dus van groot belang dat deze ziekteverwekkers goed te behandelen blijven met antibiotica. Toch worden Enterobacteriaceae steeds meer resistent tegen antibiotica. Dit begon met resistentie tegen penicillines en cefalosporines, deze antibiotica behoren tot de beta-lactam antibiotica. Enterobacteriaceae kunnen het enzym beta-lactamse produceren, dit enzym zorgt voor de afbraak van de beta-lactamring in beta-lactam antibiotica. Door de afbraak van deze ring verliezen de antibiotica hun effect. Steeds vaker gaan Enterobacteriaceae beta-lactamses produceren die van een breder spectrum aan antibiotica de beta-lactamring kan hydrolyseren, deze beta-lactamases zijn ook wel bekend als extended-spectrum beta-lactamases (ESBL). Deze ESBL’s zijn vaak nog wel gevoelig voor remmers, zoals clavulaanzuur. Enterobacteriaceae met ESBL productie zijn meestal nog wel gevoelig voor carbapenem antibiotica, dit wordt vaak nog gebruikt als laatste redmiddel. Enterobactericeae kunnen nu ook carbapenemases produceren. Deze enzymen hebben het vermogen carbapenems en andere beta-lactam antibiotica te hydrolyseren. Carbapenemase-coderende sequenties liggen vaak op plasmiden samen met andere antibioticaresistentie genen. Detectie van carbapenemases is erg belangrijk, omdat zij vaak geassocieerd zijn met uitgebreide en soms totale antibioticaresistentie.
Om inzicht te krijgen in de transmissie routes van carbapenemase genen is er een typering opgezet. Deze typering is voor de genotypische vergelijking van carbapenemase producerende Enterobacteriaceae (CPE) op basis van het plasmidoom. Het plasmidoom zijn alle aanwezig plasmiden in één bacteriestam. De typering bestaat uit drie delen. Als eerste zal het plasmidoom geïsoleerd worden uit de bacteriestam. Ten tweede zal het geïsoleerde plasmide DNA gescheiden worden d.m.v. (pulsed-field) gel elektroforese, hierdoor zal het patroon te zien zijn van het plasmidoom. Als laatste zal er een Southern blot gemaakt worden van de gel. Op deze Southern blot kan worden gehybridiseerd met probes voor replicatiegenen, gebaseerd op plasmiden sequenties van stam 1191100717 waarvan het plasmidoom is gesequenced, hierbij zijn 6 plasmiden geïdentificeerd (referentieplasmiden). Ook wordt er gehybridiseerd met probes voor resistentiegenen die op de plasmiden aanwezig zijn. Om de typering op te zetten is gebruik gemaakt van 14 Klebsiella pneumoniae stammen die zijn verzameld ten tijden van een uitbraak van CPE in het Maasstad ziekenhuis in Rotterdam. Er zijn ook nog twee Klebsiella pneumoniae stammen getypeerd uit het Maasstad ziekenhuis buiten de periode van de uitbraak. Sommige van deze stammen bevatten het carbapenemase gen OXA-48 en soms ook het ESBL gen CTX-M.
Voor de isolatie van het plasmidoom uit deze 16 stammen is gebruik gemaakt van de ‘large-construct’ kit (Qiagen) met enkele aanpassingen. De belangrijkste aanpassing was het invoegen van een proteïnase K stap na de alkalische extractie van de plasmiden, dit is gedaan om eiwit af te breken zodat dit geen pellet kan vormen samen met het plasmide DNA.
Nadat de monsters op gels zijn gebracht en zijn geëlektroforeerd, zijn hiervan Southern blots gemaakt. Bij het plasmide preparaat waarvan de plasmiden zijn gesequenced, konden 5 van de 6 plasmiden worden aangetoond d.m.v. gel electroforese en Southern blot met replicatie probes. De enige uitzondering was het grootste plasmide van 200 kb, deze is nooit aangetoond op gel of na hybridisatie op blot. Voor de ander stammen konden de kleinere plasmiden ook worden aangetoond met behulp van hybridisatie met replicatiegenen, gebaseerd op de plasmide sequenties van de referentiestam.Het CPE plasmidoom
Na hybridisatie werd ook duidelijk dat de kleine plasmiden niet alleen in supercoiled vorm aanwezig waren in het preparaat, maar ook in andere vormen, zoals open circulair en lineair. De pulsed-field gel en blot met grote plasmiden liet zien dat niet altijd de grote plasmiden worden geïsoleerd met de aangepaste isolatie methode. Zolang deze grote plasmiden niet mee geïsoleerd kunnen worden kan er ook geen complete vergelijking plaats vinden tussen verschillende stammen.