Samenvatting

Vanwege een toenemende frequentie van carbapenem-resistente Pseudomonas aeruginosa moet er onderzoek worden gedaan naar het epidemiologisch beeld van deze bacterie in Nederland. In dit onderzoek wordt er vooral gekeken naar de epidemiologie en daarnaast naar de mogelijke resistentie mechanismen. Om een beeld te krijgen van de verspreiding van carbapenem-resistente P.aeruginosa in Nederland wordt er gebruikt gemaakt van Multiple-Locus Variable-Number Tandem-Repeat Analysis(MLVA). Verder wordt er met Natrium Dodecyl Sulfaat PolyAcrylamide Gel Elektroforese(SDS-PAGE) gekeken naar de permeabiliteit van verschillende carbapenem-resistente isolaten door te kijken naar het OprD porie eiwit, en met IsoElektrisch Focussen(IEF) wordt er gekeken naar de productie van AmpC-β-lactamase in verschillende carbapenem-resistente isolaten.
De MLVA laat zien dat er binnen 127 MBL negatieve carbapenem-resistente P.aeruginosa stammen 109 MLVA-typen zijn. Dit betekent dat er weinig klonale verwantschap is binnen de carbapenem-resistente P.aeruginosa, wat volgens eerder onderzoek wel aanwezig is bij MBL positieve P.aeruginosa.
Na een paar keer te testen met SDS-PAGE is er gebleken dat de resultaten die hieruit kwamen moeilijk te interpreteren zijn op de afwezigheid van OprD, om die reden is er besloten om ook te kijken naar de RNA expressie van het OprD gen ten opzichte van het rpoD huishoud gen. Om dit te doen moest er wel eerst een Reverse Transcription- quantitative Polymerase Chain Reaction (RT-qPCR)worden opgezet. Om te kijken of er de SDS-PAGE als nog gebruikt kon worden voor dit onderzoek is deze techniek ook geoptimaliseerd door te kijken naar het percentage gel en de hoeveelheid monster met een bepaalde optische dichtheid. Het resultaat wat hieruit kwam was dat er het beste een 12% polyacrylamide gel gebruikt kon worden en ook dat de beste hoeveelheid monster dat op de gel geplaatst moest worden 12-15μl was. Bij het opzetten van de RT-qPCR moesten er een aantal factoren worden geoptimaliseerd: de annealingstemperatuur, de concentratie primers van het OprD gen, de concentratie primers van het rpoD gen en de magnesiumchloride concentratie. De optimale annealingstemperatuur is bepaald agarose gel elektroforese en hieruit is gebleken dat 58oC de beste annealingstemperatuur was. De optimale primer concentraties en de optimale magnesiumchloride concentraties zijn bepaald door te kijken in de qPCR naar de smelttemperatuur van het product, de afgeleide van de amplificatie plot, het aantal cycli waarbij de drempelwaarde werd bereikt en de hoogte van de amplificatie plot. Van al deze gegevens is een procentuele verandering gemaakt ten opzichte van de standaard concentratie primers en magnesiumchloride. Hieruit is de conclusie gekomen dat de optimale concentratie voor de OprD primers 0,5μM is, de optimale concentratie voor de rpoD primers is 1μM en de optimale concentratie magnesiumchloride is 4mM.
Er zijn 47 stammen getest op de aanwezigheid van AmpC-β-lactamasen en op de aanwezigheid van andere β-lactamasen met uitzondering van metallo-β-lactamasen, in deze 47 stammen zaten ook vier VIM-2 positieve stammen. Deze VIM-2 stammen waren in een eerder onderzoek door middel van PCR positief getest op VIM-2. Binnen de 47 getest stammen waren er 12 AmpC-β-lactamasen gevonden en 15 andere β-lactamasen, er waren twee stammen waarin AmpC-β-lactamase en een ander β-lactamase aanwezig was, er was één stam waarin twee β-lactamasen aanwezig waren en er waren twee VIM-2 stammen die naast VIM-2 een ander β-lactamase hadden.