Samenvatting

Sphingolipiden zijn polaire lipiden die gevonden worden in celmembranen en zijn de laatste decennia belangrijk geworden vanwege de mogelijke ziekte voorspellende waarde. Deze grote klasse van lipiden is onderverdeeld in drie subklassen: ceramiden, sphingomyelinen en glycosphingolipiden. De basismolecuul is 18-koolstof amino alcohol sphingosine. Sphingosine heeft twee functionele groepen (amino en hydroxyl) die chemisch gemodificeerd kunnen worden om verschillende sphingolipiden te maken. De meest bestudeerde sphingolipiden zijn sphingosine-1-phosphate en ceramide. Cruciaal is het evenwicht tussen de sphingolipiden ceramide en sphingosine-1-phosphate, omdat deze twee verbindingen op verschillende vlakken een tegengestelde werking hebben. Ceramide is bijvoorbeeld in de meeste celtypen een apoptose-inducer die aanzet tot celdood, terwijl sphingosine- 1-phosphate juist mitogeen werkt en de celdeling bevordert.

De afdeling Farmacologie en Farmacotherapie van het Academisch Medisch Centrum Universiteit van Amsterdam doet hoofdzakelijk onderzoek op het gebied van de cardiovasculaire en urogenitale farmacologie. Eén cardiovasculaire researchlijn betreft onderzoek naar de rol van sphingolipiden en sphingolipid-receptoren. Een assay voor sphingosine-1-phosphate als biomarker in lichaamsvloeistoffen is reeds ontwikkeld. Er bestaat behoefte aan snelle, gevoelige en selectieve methoden om sphingolipiden, specifiek sphingosine-1-phosphate, te bepalen in onder andere cellen.

Het uitgevoerde onderzoek heeft als uitgangspunt een combinatie van de bestaande methode van de afdeling Farmacologie en Farmacotherapie (Butter, Koopmans en Michel, 2005) en de methode zoals beschreven door Andréani en Gräler (2006). Deze combinatie wordt als volgt omschreven: een sphingosine-1-phosphate assay high-performance liquid chromatography bepaling ontwikkelen met 9- fluorenylmethyl chloroformate derivatisering gebruikmakend van een high-performance liquid chromatography isocratisch systeem zonder kolom verwarming; als eluens het organische deel acetonitril in plaats van methanol; solid phase extractie in plaats van vloeistof/vloeistof extractie; binnen een acceptabele analysetijd.

Gebruikmakend van de eluens 70% acetonitril in dikaliumwaterstoffosfaat 15 mM pH 9,3 geeft een retentietijd van 16,1 minuten voor D-erythro C17 sphingosine-1-phosphate (deze wordt gebruikt als interne standaard), 23,3 minuten voor sphingosine-1-phosphate en 32,2 minuten voor sphinganine-1- phosphate. De recovery van sphingosine-1-phosphate met solid phase extractie is 63% ten opzichte van indampen met stikstof.

Omdat 9-fluorenylmethyl chloroformate een hoog front geeft wordt asparaginezuur als stopreagens gebruikt om deze met de overmaat van 9-fluorenylmethyl chloroformate te laten reageren. De standaard calibratielijn van 0 - 1 - 2 - 3 - 4 μg/ml van sphingosine-1-phosphate geeft een regressie coëfficiënt van R = 0,997142 en R2 = 0,994292. Deze calibratielijn is na 24 uur bij kamertemperatuur 2 te hebben laten staan nogmaals gemeten. De standaard calibratielijn geeft een regressie coëfficiënt van R = 0,99789 en R2 = 0,995785. De 9-fluorenylmethyl chloroformate derivaten zijn stabiel.

Er is gekeken naar de effecten van tijd, temperatuur, pH en verschillende buffers op de labeling. Naarmate de tijd van de labeling van 9-fluorenylmethyl chloroformate toeneemt, neemt ook de respons (piekoppervlakte) toe. Als gevolg hiervan neemt de gevoeligheid toe. De standaard calibratielijn van 0 - 1 - 2 - 3 - 4 μg/ml van sphingosine-1-phosphate geeft de volgende resultaten: R = 0,995714 en R2 = 0,991446 na 3 minuten; R = 0,999127 en R2 = 0,998255 na 5 minuten; R = 0,999945 en R2 = 0,99989 na 10 minuten. De labelingstijd van 10 minuten geeft een betere lineariteit. Er is een vergelijking gemaakt van de labeling bij kampertemperatuur en bij een waterbad van 40ºC. Wanneer de labelingsstap in het waterbad van 40ºC plaatsvindt, vervolgens asparaginezuur wordt toegevoegd en deze direct wordt gemeten, daalt het front binnen 5 minuten. Omdat dikaliumwaterstoffosfaat bij pH 9,3 weinig bufferingscapaciteit heeft wordt naar verschillende pH-waarden en verschillende buffers gekeken. De uitkomst hiervan is dat dikaliumwaterstoffosfaat pH 9,3 uiteindelijk toch het beste resultaat geeft.

Er wordt een standaard calibratie gemaakt in 100 μl foetal calf serum. De standaard calibratielijn van 0 - 1 - 2 - 3 - 4 μg/ml van sphingosine-1-phosphate geeft de volgende resultaten: R = 0,999253 en R2 = 0,998506. Met deze methode ligt de detecteerbaarheid bij circa 0,1 μg/ml en de ijklijn loopt lineair vanaf 0,5 μg/ml. 3