Samenvatting

C. elegans is een nematode van ~1 mm groot, dat veel gebruikt wordt als een modelorganisme voor het bestuderen van ontwikkelingen en gedrag. Het gebruik van C. elegans als modelorganisme heeft een aantal redenen; korte generatietijd van 3 dagen, het is een simpel meercellig organisme (959 cellen) en makkelijke kweekomstandigheden. Bovendien is het gehele genoom bekend. Dit maakt C.elegans een uitermate geschikt organisme voor genetisch onderzoek.
De laatste jaren is er steeds meer bekend geworden over verschillende kleine RNA mechanismen. Eén daarvan is het microRNA mechanisme. Dierlijke microRNAs zijn kleine niet coderende RNAs die de translatie van messenger RNAs reguleren. Doordat de microRNAs imperfect binden in de 3’untranslated region (3’UTR, regio na stopcodon waarvan geen translatie plaatsvind) van de messenger RNAs, onderdrukken ze de translatie van deze messenger RNAs.
Dit in tegenstelling tot het RNAi mechanisme en het plant microRNA mechanisme. Deze mechanismen functioneren ook door binding aan de messenger RNAs maar dit leidt tot degradatie van het messenger RNA. Doordat dierlijke microRNA imperfect binden aan het messenger RNA, verbreden ze het spectrum van messenger RNAs waar ze aan kunnen binden. Tegelijkertijd bemoeilijkt deze eigenschap de voorspellingen die berekend zijn voor de doelgebieden door verschillende algoritmes.
In deze studie gaan we deze voorspellingen van doelgebieden na voor microRNA-42, 43 en 44. Hiervoor maken we gebruik van mir-42-44(gk177) dieren, welke een gestoorde locus voor mir-42 en 43 bevatten, en wildtype dieren.
Op de Universiteit Utrecht hebben ze een aantal eiwitten geïdentificeerd welke verschillend tot expressie kwamen in mir-42-44(gk177)dieren en wildtype dieren. Wij hebben de geïdentificeerde eiwitten die opgereguleerd zijn in de mir-42-44(gk177) dieren gebruikt voor onze analyse.
Het doel van dit onderzoek was het vinden van endogene doelgebieden voor mir-42, 43 en 44 die door drie algoritmes voorspeld waren. We waren ook geïnteresseerd in de regulerende functie van deze miRNAs. Daarom zijn we nagegaan of mir-42, 43 en 44 de translatie van messenger RNA onderdrukken. We hebben dit gecontroleerd met een proteomic approach (eiwitten benadering).
Allereerst hebben we de resultaten die we via de Universiteit van Utrecht verkregen hebben gecontroleerd. We hebben een Western blot op UNC-60B uitgevoerd om de geïdentificeerde eiwitten te controleren. UNC-60B is een eiwit die in mir-42-44(gk177) dieren lager wordt gereguleerd dan in de wildtype dieren. We determineerde inderdaad een lagere expressie van UNC-60B in de mir-42-44(gk177) dieren in tegenstelling tot wildtype dieren. Met deze resultaten kunnen we waarschijnlijk concluderen dat de identificatie van de eiwitten op een correcte manier is uitgevoerd op de Universiteit van Utrecht. Vandaar dat we de opgereguleerde eiwitten hebben gebruikt voor onze experimenten.
Vervolgens hebben we de doelgebieden voor miRNA-42, 43 en 44 gecontroleerd in de mir-42-44(gk177) dieren en wildtype dieren door gebruik te maken van een reporter-construct welke het groen fluorescerende eiwit (GFP) bevat. We hebben voor twee opgereguleerde eiwitten een construct gemaakt, het glh-1 3’UTR en iffb-1 3’UTR construct. Glh-1 3’UTR heeft een voorspelling voor mir-44 in de 3’UTR en iffb-1 3’UTR voor mir-43.
Voor de glh-1 3’UTR en iffb-1 3’UTR constructen hebben we verschillend regulatie in mir-42-44(gk177)dieren en wildtype dieren waargenomen. Er was meer expressie van GFP in de mir-42-44(gk177) dieren in tegenstelling tot wildtype dieren. Bovendien determineerden we een statistisch significant verschil bij de glh-1 3’UTR construct. Hoogst waarschijnlijk kunnen we hieruit concluderen dat het doelgebied van mir-44 aanwezig is bij de glh-1 3’UTR. Voor de glh-1 3’UTR en iffb-1 3’UTR kunnen we waarschijnlijk aannemen dat mir-42, 43 en 44 de translatie onderdrukken van de messengerRNAs.